在分子遗传学上的许多发展已经对原核生物的基因认知，开启了崭新的一页。然而，一个已知基因的DNA序列本身却只包含了有限的信息，所以，将一个未知的的基因及其所表现出的蛋白的明确作用阐明，是十分重要的。
基因转殖技术的发展已经使得我们可以选择性地删除或加入一个已知的基因，这些实验方法的利用提供了对生物发育方面许多问题的探讨方式并开拓许多应用空间，基因转殖技术已经成了分子生物学与其它生命科学间的桥梁。
利用基因转殖技术将DNA送入早期哺乳类动物的胚胎中的主要目的是，能将基因稳定的植入动物的基因组(genome)中，并且会一质遗传下去。约在十几年前，首先利用这项技术做研究的科学家，就认知了采用实验老鼠当作主要的研究模式是十分有利的。而选择适当且清楚其特性的老鼠品系对于基因转殖技术的运用也是非常重要的。
目前用来生产基因转殖动物的方式总共有三种：
1. 利用反转录病毒感染胚胎的胚叶细胞(blastomeres)是将转殖基因送入germline的方式之一。但对于要产生基因转殖动物，反转录病毒质体只占了小部份的重要性，主要是因为它有其限制：它所能携带的插入基因，不能大于7Kb。
2. 利用微量注射的方式将重组过的DNA直接注入授精卵的原核中，是目前最常使用的方式，而此方法也是用来产生其它种的基因转殖动物，如：大鼠(rat)，兔子(rabbit)或农场所饲养的动物(farm animal)。YAC(Yeast Artificial Chromosome)上大到数百kb的DNA片段，也可以用此方法送入受精卵中。通常，数个重复的欲植入基因会同时插入同一个基因组的位置。这些插入的转殖基因，可以藉由in situ hybridization 来确认位置，可惜的是，转殖基因插入的位置并不能事先测得。所以，每一个原源种转殖基因的动物(founder animals)必须建立起他自己独立的转殖基因动物株(transgenic line)。
对于加入DNA序列，反转录病毒及微量注射的方式都有其限制。另外有一种基因操控(genetic manipulation)方式是：藉由基因标地(gene targeting)的方式将特定的变异(mutation)转入培养的胚株细胞中(embryonic stem cells, ES cells) 。这个方式的主要原理是以转殖进去的DNA片段(transfected DNA fragment)对原本染色体上的基因进行替换改造。
胚株细胞(ES cells)是来自于囊胚(blastocyst)中的细胞团(inner cell mass)的细胞，在特定的培养条件下，它们可以增生并且维持可以变成小鼠体内任何器官的能力。而植入的DNA，称之为标的构筑质体(targeting construct)，大多都是藉由电转殖(electroporation)将它转殖进入细胞内。经由特殊药物筛选，并利用聚合 连锁反应(PCR)或南方点墨法(Southern blot)方式找出基因已改造的细胞，再将此细胞经微量注射注入囊胚的空腔中(cavity of blastocyst)，或用桑葚体聚集 (morula aggregate)方式，将ES cells加入发育胚胎。最后，再将处理过的胚胎植入假孕的代理孕母(pseudopregnant surrogate mother)体内。
基因转殖与基因标的被用于改造老鼠的基因，这已经是许多实验室中十分重要的技术了。同时，也有实验室致力于将这种实验方法应用在养殖的农场动物上。就我们现在所知，必须将技术改进，使之可以建立更多不同动物的多发性(pluripotent) ES cells，并增加利用微量注射产生其它基因转殖动物的效率。基因转殖的农场动物在未来最大的远景是在药品制造以及器官移植方面。
虽然基因转殖动物模式在基础生物研究上日趋重要，但是这些新技术同时也对许多研究人员产生一些困难。微量注射后转殖基因随机插入所产生的位置效应(positional effect)、基因质体植入数目(copy number)的差异、转殖基因的调节子(regulatory element)的丧失…等因素，都会造成不同转殖基因动物株间，其转殖基因表现程度的质与量有很大的差别。同时，暂时性的不当表现也会发生。因为不同生物特性的复杂性，仅在某些少数的例子中，基因标地的研究成功地提供基因删除(null mutation)与基因改造过的老鼠间，一对一的差异比较。如genetic redundancy则会有补偿机制(compensatory mechanisms)，导致模糊了基因改造后的结果。
为了减少这些可能混淆的反效果，两种产生基因转殖动物的方法(pronuclear microinjection、embryonic stem cell)都必须更进一步地推敲、琢磨。最近有许多关于真核生物的基因调节(gene regulation of eukaryotes)的新研究，利用原核生物的DNA序列，如：Cre-loxP site-specific recombination，来对哺乳类动物进行基因改造;或是E. coli 的tet operator/repressor system从事转殖基因表现的操控…等，都对基因转殖方法的发展有很大的冲击。另外，对于免疫方面以及神经科学方面的研究，动物的基因背景(genetic background)尤其要列入考虑之列。特定基因的突变株与在同一基因背景表现转殖基因的动物常需要固定的近亲背景下才能进行有意义的研究。
为了加强对复杂的调节交互作用的了解，我们需要有多重基因改变(multiple genetic alteration)的基因转殖动物。有一些十分有效的方法可以有条件式的在哺乳类动物上作基因突变。利用外在方式控制基因表现或是改变内在基因(endogenous gene)的可能性，可以使我们避免转殖基因永久性地被删除或是转殖基因不稳定的表现。
原核微量注射方式最常用于转殖基因表现的研究，而ES cells方式则是最常被用于剔除内在基因的研究。然而，仍有很多其它的研究方法与应用对于基因改造动物的使用上，有独特的贡献。举例来说，转殖基因的过量表现(over-expression)、特定组织的表现(tissue specific expression)、基因删除的诱导、条件式突变(conditional mutation)、蛋白质构造与功能的研究与产生与人类遗传疾病相似的动物模式…等，都是相当重要的课题。
原核微量注射方式产生的基因转殖鼠可运用于下列的研究方面：
1. 基因在生物体内的调节研究(study of in vivo gene regulation)
2. 启动子(promotor)分析
3. 生物工厂(biofactories)
4. 蛋白质的构造与功能研究(study of protein structure/function)
5. 功能剔除(functional knockout)
6. 除去特定细胞型(cell type ablation)
7. 遗传基因的反转(reverse genitic)
8. 遗传疾病机转的模式(models of mechanisms of genetic diseases)
利用基因标地的ES cells产生的基因转殖鼠可运用于下列的研究方面：
1. 设计突变(designed mutations)
2. 基因在生物体内的调节研究(study of in vivo gene regulation)
3. 蛋白质的构造与功能研究(study of protein structure/function)
4. 遗传疾病机转的模式(models of mechanisms of genetic diseases)
5. 基因、启动子或促进子罗网(gene，promotor or enhancer trap)
6. 基因剔除突变(null mutations)
I. 基因转殖技术的发展
早在基因重组技术(recombinant DNA technique)被广泛运用的时期，就已经有将基因直接植入老鼠胚胎的第一篇研究报导。1974年， Jaenisch 及Mintz发现：若将纯化的SV40 DNA注入老鼠的胚母细胞腔(blastocoele cavity)中，在该胚胎发育成鼠之后，可以在老鼠体组织中侦测到注入的DNA。由此可以推断：注入的DNA可以插入胚胎细胞的染色体组(genome)内。
在1980，由Gorden et al.将Herpes Simplex Virus(HSV)的 thymidine kinase (TK)基因利用微量注射方式注入培养的纤维细胞(fibroblast)之细胞核中，发现约有5~20%的细胞含有注入的基因且稳定表现该基因。同年，Gorden et al.发表了第一篇有关成功地经由微量注射(microinjection)将基因转殖到老鼠体细胞中的研究报告。随即，也有不少研究单位利用相同的方法植入许多转殖基因。此方法将基因构筑质体(genetic construct)微量注射到老鼠之授精卵中，然后将注射过的卵再送入假孕(pseudopregnant)母鼠体内。再确认所生出的小鼠后代是否正确地带有植入的基因及其表现状况。
在以往这些技术被运用在某些特定的动物上，如：小鼠(mouse)、大鼠(rat)、兔子(rabbit)、猪(pig)、羊(goat)以及牛(cow)。
基因转殖技术最主要的目的是发展出新的动物模式(animal models)，尤其在尚未有适当动物模式以研究疾病时。其最著名的例子便是囊性纤维病变(cystic fibrosis，CF)。
1981年，Evans and Kaufmann 及Martin两个实验室，将从囊胚(blastocyst)中的胚株母细胞(embryonic stem cells，ES cells) 利用在基因转殖上，已经促使这技术更加的蓬勃发展。随即，研究发现若将胚株母细胞利用微量注射方式注入囊胚中，并使之发育成鼠，则胚株母细胞便有能力发育成嵌合体老鼠(chimera)身上的任何一个组织，包括生殖细胞(germ line)。
胚株母细胞的发现并将它当成基因传到子代的媒介，尤其以基因标的(gene targeting)方面，已经在实验方法上引起了革命性的进步。基因转殖老鼠对生物研究上产生了许多冲击，并且增加我们对基础科学问题的了解，包括:基因表现(gene expression)、癌症发生(cancer induction)以及生物发生学(developmental biology)。此外，基因剔除(gene knockout)实验对于实验病理学(experimental pathology)更具有极大的贡献。
II. 基因转殖技术的要件
接着介绍的是有关会影响基因转殖技术的重要动物变因
A. 动物无特殊病源株(specific pathogen free colony，SPF colony)
动物健康总是受到许多感染源所危害。感染很容易被较明显且严重的损伤所掩盖住，且临床上的疾病会迟至动物在承受压力(Under stressed) ，如实验过程中才会被发现。
虽然需要某些特别注意事项，以避免病源扩散或可能受到病源的感染，但具SPF株的基因转殖囓齿类可以不需特别隔离地运送。
维持SPF株的优点,简述如下:
1. 在繁殖(breeding)与存活(survival)方面：SPF动物较健康，活得较久，动物不致因感染而丧失。
2. 在实验方面：因不同的感染，在动物有不同生理现象受到影响，包括：行为、生长率、器官的相对重量、免疫反应以及癌细胞的生长。感染也有可能会污染生物研究质量(biological material)，如：细胞培养，细胞株及生物产物。SPF质量减少了动物性的疾病，且提供了研究的可信度(reliability)与再现性(reproducibility)。
3. 在基因型(genotype)方面：基因转殖动物中，被修改基因所产生的基因型，与环境间之相互作用往往是最无法预测的，而且容易由于不易繁殖而失去该动物株及相关研究，但SPF可以避免此类的问题。
4. 在基因转殖动物的运送方面：具SPF质量的基因转殖动物可以直接运送到另一个无病源的场所(facility)，不需多花3-6个月的监测过程。
5. 在花费方面：将基因转殖动物维持在无菌且避免感染的条件下所需花费较传统方式来得昂贵，但若将可能因感染而失去基因转殖动物株，或无法使实验结果再现….等等后果考虑进去，则传统方式有可能会花费较高。
6. 在野生囓齿动物方面：将基因转殖动物饲养维持在正压的隔离盒 (isolator)中或者SPF的保护中，可以避免基因转殖动物与野生囓齿动物的接触。
相对地，若干维持SPF株的缺点，如：
7. 方便性：取得SPF动物较不易且费时。
8. 基本组织与建设(infrastructure)：SPF动物的饲养需要特殊的仪器设备，因此实验进行会受限于SPF所需的环境。
总括而论，SPF品质的基因转殖动物需求量与日俱增。长远来说， SPF质量的动物不必因为健康问题而被扑杀，如此便可节省时间以及实验动物的需要量。
B. 胚胎提供者的基因型(genotype of the donor)
为取得较大量的卵母细胞(oocyte)及胚胎(embryo)，必须考虑下列几项因素：
1. 具有好的 plugging performance 及高精虫数的公动物十分重要。
2. 动物必须对PMSG(Pregnant Mare Serum Gonadotrophin)及hCG(human Chronic Gonadotrophin)具可受性。
3. 具有足够量的足龄动物可供使用。
如果基因背景(genetic background)对实验上并非必要因素时，一般而言，都可利用第二代杂交合体(F2 hybrid zygote)来作微量注射，由第一代杂交(F1 hybrid)的公与母动物交配后所得到的授精卵及后续对基因转殖动物的繁殖，远比利用同系交配亚型(inbred strains)来得容易。
对大多数的实验而言，将基因转殖入特定基因背景是十分重要的，且比胚胎的不利性(embryological disadvantage)还重要。
C. 受孕者(recipient)的基因型与卫生状况
随机配种或F1杂交囓齿动物均是可以胜任的受孕者。某些母动物具有很大的壶腹(ampullae)以利胚胎植入，通常也具有十分良好的母性。若使用与胚胎相关的F1杂交亚型(strain)会使得成功率提高。
如果在无菌状态下植入胚胎，SPF级的受孕体必须被饲养在SPF条件下的饲养盒中，一旦小动物出生且离乳(weaning)之后，受孕母体则可拿来做微生物的检测，以便提供新生鼠健康监测数据。
基因转殖技术：实验方法
A. 微量注射(microinjection)
最常用来生产基因转殖动物的方式为：直接把重组过的DNA注入授精卵的原核(pronuleus)中，将从胚胎提供者的输卵管中取得的授精卵移到微量注射台上，然后利用固定吸量管(holding pipette)固定住，之后，注射针则依序穿过zona pellucida，oocyte membrance及male pronuleus membrane后， 将DNA注入， 注入时可以见到原核膨大。
注射过的授精卵则在无菌状态下植入SPF条件的假孕母体中，仔体则利用进行聚合脢连锁反应(polymerase chain reaction，PCR) 或南方点渍(southern blot)来检测植入的基因，以确定基因转殖动物。由注射过的授精卵发育成的动物通常称为原源种动物(founder animals)， 从有基因表现的founders而产生的基因转殖株，依其基因型被以半接合子(hemizygous)或同接合子(homozygous)型态保存。
B. 囊胚注射(blastocyst injection)
胚株母细胞的发现并将它当成基因传到子代的媒介,尤其以基因标的(gene targeting)方面，已经在实验方法上引起了革命性的进步。现今，此技术多半局限应用于改造小鼠的基因，其它的动物， 如：大颊鼠(hamster)、猪(pig)、羊(sheep), 牛(cattle)、及貂(mink)则很少用。基因转殖小鼠对生物研究上产生了许多冲击，并且增加我们对基础科学问题的了解，包括：基因表现(gene expression)， 癌症发生(cancer induction)以及生物发生学(developmental biology)。此外，基因剔除(gene knockout)实验对于实验病理学(experimental pathology)更具有极大的贡献。
C. 微量注射/(microinjection)
目前这两种技术的联合运用最广的是：Cre/loxP system。经由精确的将DNA移除，则可把内生的基因(endogenous gene)或植入的基因(transgene)去除，同时活化或关闭殖入基因。这项技术在Dr. PlUck 所发表的研究报告中有详尽的介绍。
D. 基因移除(有条件的基因删除, conditional gene deletion)
对于一些利用传统基因剔除实验而引起胚胎早期会导致死亡(early embryonic lethality)的基因而言，Cre/loxP system 是一个十分有利的方法，因为此方法具有组织与时间专一性(tissue-specific and time-specific)。它也可以利用于将在特定组织中过度表现(over-expression)的转殖基因除去，以研究转殖基因负调节(down regulation)的反向效果(reverse effect)。
在利用有条件的基因删除方法中，有两株老鼠是必须的：1) 在特定组织或细胞型中含有Cre recombinase 的基因转殖鼠； 2) 在一个欲删除基因的两端插入两个同向的loxP 序列的老鼠。将基因剔除的重组反应只在有Cre recombinase表现的细胞中发生。 如此一来，目标基因在其它不表现Cre recombinase的组织中仍是活化的。
E. 基因活化
Cre 的DNA剪断(DNA excising)能力，若用于将基因中介于promotre 及coding region的stop sequence去除，则可以用来活化外来基因。
一株在特定组织或细胞型中含有Cre recombinase 的基因转殖鼠，加上一株含有转殖基因的老鼠，则基因重组如：去除stop sequence，发生在含有Cre recombinase 的组织中时，就可依Cre construct 的特异性来去除想去除的基因序列。如此一来， 转殖基因可以在活化的特定组织中被DNA polymerase 转录，其它不表现Cre recombinase的组织则不行。
F. 反转录病毒载体
在反转录病毒的生命周期中有一个步骤是会将双股的前病毒(provirus)DNA插入寄主的染色体组中，这个将DNA插入的过程是由反转录病毒所合成的蛋白质所进行的，这插入过程是十分准确的， 所以不会发生重组或是染色体组的基因删除。一旦将病毒的DNA插入之后，病毒的DNA会被当作一般的基因组来保持，同时随着寄主进行有丝分裂(mitosis)及减数分裂(meiosis) 。若将provirus送入老鼠的基因体组中，可以产生随机的突变(random mutation)，因为可以追踪到provirus，所以利用它所产生的突变很容易被确认及分离出来。
